Россия

lab@ noykem.ru

Москва: (499) 346-39-14,  (495) 77-46-319   Новосибирск: (383) 363-85-90 (многоканальный)

Наша задача - обеспечивать Ваши лаборатории качественной продукцией

 

Автор: 
Григорьева Евгения Сергеевна (младший научный сотрудник), совместно с Карбышевым М.С.(1,2), Волкоморовым В. В.(1)
Организация: 
(1) ФГБУ НИИ онкологии СО РАМН, Отдел экспериментальной онкологии, Лаборатория иммунологии, г. Томск; (2) ФГУП НПО Микроген" Миздравсоцразвития России, филиал в г.Томск «НПО «Вирион», Отделение разработки и экспериментального производства препаратов
 
Конкурсная работа: 

   Антитела представляют собой уникальные по эффективности и специфичности инструменты для исследований в различных областях биологии, химии и медицины. Применение антител является важным элементом комплексных подходов к лечению большого числа социально-значимых заболеваний. Особое место среди них занимают онкологические заболевания, которые являются одной из основных причин смертности на планете. Использование препаратов антител в диагностике и лечении злокачественных новообразований открывает широкие перспективы для практического здравоохранения.
   Проведя экспериментальное сравнение белковых профилей опухолевой и нормальной тканей желудка, мы выявили панель потенциальных белков-маркеров, которые могут быть использованы для диагностики рака желудка. Однако использование коммерчески доступных антител оказалось неэффективным для детекции отобранных нами потенциальных маркеров, в связи с их низкой чувствительностью. Таким образом, нами была поставлена задача получения высокоспецифичных антител для детекции выявленных белков на клиническом материале.

 

Материалы и методы исследования

   Культуральный пластик TPP: культуральные матрасы, 25 см2 (кат. # 90025)и 150 см2(кат. # 90150), система для вакуумной фильтрации 1000мл(кат.#99955), пробирки центрифужные 15 мл(кат.# 91515), фильтрующая насадка для шприцев 0,22 мкм(кат. # 99722).
   Культуральный пластик (прочие производители): культуральные матрасы, 25 см2, роллерные бутыли InVitro PETG.
   Клетки гибридомы: крысиная гибридома С6С продуцирующая моноклональные антитела изотипа IgG2b к белку Х (потенциальному биомаркеру рака желудка) адаптирована к культивированию на бессывороточной среде Hybridoma Express Plus (PAA) с добавлением 20 мМ HEPES и 1x раствора гентамицина.
   Культивирование клеток: для масштабной наработки продуцентов были использованы роллерные бутыли InVitro PETG (Nunc), которые помещались в инкубатор, при 37оС и 60 об/мин. При достижении клеточной поуляциейплотности3х106 кл/мл гибридомы субпассировали в 25 см2 культуральные флаконы, разных производителей,со свежей средой (пассаж 1). Динамика продукции антител анализировалась при культивировании клеток гибридом в 150 см2 культуральных матрасов TPP (пассаж 2).Флаконы с клеточными культурами помещали в СО2-инкубатор (Sanyo) и инкубировали при 37оС в атмосфере 5% СО2; при проведении экспериментов в 150 см2 культуральных матрасах осуществляли встряхивание на орбитальном шейкере при 45 об/мин.
   Контроль роста клеток и продукции антител: для контроля динамики роста клеток отбирали пробы из культуральных флаконов в асептических условиях (нас последующим подсчетом клеток на гемоцитометре. Дискриминацию живых и мертвых клеток осуществляли с использованием красителя - трипановый синий (Sigma). Концентрацию антител в культуральной жидкости определяли с помощью иммуноферментного анализа с использованием диагностического препарата иммуноглобулина козы против IgG (H+L) крысы, меченного пероксидазой хрена (Имтек).
   Выделение и очистка антител: хроматографическую очистку антител выполняли на хроматографе AKTA Explorer 100 Air (GE Healthcare) c использованием колонки HiTrap Protein G 5 ml (GE Healthcare). Полученные в ходе очистки фракции объединяли и концентрировали с применением Amicon-15 (Millipore), чистоту конечного препарата контролировали электрофорезом в 16% ДСН-ПААГ.

 

Результаты и обсуждение

   Проводили сравнительный анализ культуральных матрасов 5 различных производителей, а именно, TPP (каталожный номер 90150), и аналогичные продукты других производителей лабораторного пластика.

   Рисунок 1 – Общее количество клеток и количество живых клеток при культивировании гибридомы во флаконах различных производителей.
   Примечание – Производитель №1 - TPP.

 

   Для получения гибридомы, продуцирующей моноклональные антитела к потенциальному маркеру, использовали клетки миеломы YB2/3.0.Ag.20 и клетки селезенки крыс линии Lou. Среда для культивирования гибридомных клеток была приготовлена из сухого концентрата (PAA, ФРГ), стерилизовали фильтрованием с использованием системы для вакуумной фильтрации (TPP, Швейцария), что позволило избежать контаминации и “пророста” среды. Для поддержания стабильных  значений pH в среде, клетки гибридомы культивировали в CO2-инкубаторе при температуре 37°С, в течение 10 дней. Для получения большего количества клеток, продуцирующих антитела, клетки гибридомы субпассировали в культуральные флаконы. Наиболее удобными в процессе экспериментальной работы оказались флаконы TPP, ввиду эргономичной геометрии горловины, а также абсолютной прозрачности пластика.
   Контроль над ростом клеток осуществляется путем асептического отбора проб из ферментера с последующим подсчетом клеток на гемоцитометре. Наилучшие показатели клеточного роста были отмечены в 3 флаконах -производители № 1, 3, 4. На 8 день количество жизнеспособных клеток достигло пика, после чего 8х105 клеток из флакона производителя №1 пересевали во флакон с 25 мл свежей среды (пассаж 2), анализировали дальнейший рост гибридомных клеток и продукцию антител.

   Рисунок 2 – Динамика воспроизведения биомассы клеток гибридомы С6С и продукции антител при культивировании в 150 см2 матрасах (ТРР).

 

Как видно из приведенных на рисунке 2 данных, образование антител продолжается даже после того, как клетки перестали пролиферировать. Очевидно, что синтезированные антитела не сразу секретируются клетками в культуральную среду. Позднее, в фазе отмирания, клетки лизируют и высвобождают находящиеся в них антитела. Полученные результаты побудили провести специальные эксперименты по определению содержания антител в клетках в фазах роста и отмирания. Полученный после культивирования раствор содержит моноклональные антитела в низкой концентрации, поэтому для облегчения последующих операций осуществляли его концентрирование с помощью ультрафильтрации в тангенциальном потоке, что способствует также, удалению воды и низкомолекулярных примесей. Затем моноклональные антитела были очищены с использованием белок-G-сефарозы, специфичность подтверждали на иммуногистохимическом тесте на образцах тканей.

 

Выводы:

  1. При культивировании клеток гибридом в культуральных флаконах различных производителей, максимальная плотность живых клеток (1,8 x106 клеток/мл) была отмечена в тестируемых образцах от производителя № 1 (ТРР).
  2. Продукция антител была максимальной на 18 день эксперимента (составила 95,7 мкг/мл), несмотря на значительное снижение количества жизнеспособных клеток.
  3. Полученные высокоспецифичные антитела к потенциальному диагностическому маркеру могут быть использованы в качестве основы для создания диагностической тест-системы для выявления злокачественных новообразований желудка.

 

КОМИКС-ПРИЛОЖЕНИЕ.
Приключения «лабораторного питомца» по имени Внеземная Контаминация

 

Рисунок 1 – Контаминация замечена в непосредственной близости от культуральных флаконов

 

Рисунок 2 – Контаминация пристально наблюдает за ходом работ

 

Рисунок 3 – Ничто не предвещало беды, но нежелательная контаминация пыталась сорвать эксперимент

 

Рисунок 4 – Как контаминация не старалась, она не смогла проникнуть внутрь культуральных флаконов

Это интересно!

Молодые коалы пахнут как леденцы от кашля.

НАШИ ПРОЕКТЫ

 

КУЛЬТУРАЛЬНАЯ ПОСУДА

ВИДЕО     ОБЗОР ТОВАРОВ     КАТАЛОГ

 


 

КРИОГЕННОЕ ОБОРУДОВАНИЕ

ВИДЕО     ОБЗОР ТОВАРОВ     КАТАЛОГ

ЗАПОЛНИТЬ КРИО АНКЕТУ

 


 

КОМПЛЕКСНЫЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

 

 

для центров ЭКО:   сайт   прайс

           для ЦГиЭ:   сайт   прайс

 


 

ОПТОВЫЕ ПОСТАВКИ РЕАКТИВОВ

Касторовое масло LUVOTIX R

1,4-Нафтохинон

Корзина

Итоговая сумма:   0.00 Руб.
В корзину
www.noykem.ru
lab@ noykem.ru
(499) 346-39-14, (495) 77-46-319
(383) 363-85-90 (многоканальный)


Copyright (с) 2013 - 2017 ООО "Нойкем"