Россия

lab@ noykem.ru

Москва: (499) 346-39-14,  (495) 77-46-319   Новосибирск: (383) 363-85-90 (многоканальный), 332-80-42, 332-41-37

Наша задача - обеспечивать Ваши лаборатории качественной продукцией

Автор: 
Кунгурцева Ольга Владимировна (старший научный сотрудник)
Организация: 
Государственное научное учреждение Институт экспериментальной ветеринарии Сибири и Дальнего Востока Россельхозакадемии (ГНУ ИЭВСиДВ Россельхозакадемии), п. Краснообск, Новосибирская область
 
Конкурсная работа: 

   Реакция нейтрализации является наиболее чувствительной и специфичной из всех существующих серологических реакций. Обычно ее используют для постановки диагноза на прошедшую инфекцию, а также выявления латентного вирусоносительства у животных.

   Сущность реакции нейтрализации заключается в способности антител сыворотки крови подавлять репродукцию вируса в культуре клеток (in vitro).

   В настоящее время для животноводческих хозяйств Новосибирской области остаются актуальными некоторые экономически значимые вирусные болезни крупного рогатого скота, к которым относится вирусная диарея-болезнь слизистых оболочек (ВД-БС). Диагностика этого заболевания включает проведение комплекса серологических исследований с помощью реакции нейтрализации, которую ранее ставили макрометодом. Этот метод предполагает трудоемкий процесс с большими затратами времени и реактивов.

   В нашей лаборатории был усовершенствован метод постановки реакции нейтрализации микрометодом, с использованием 96-луночных плоскодонных планшетов.

   Целью данной работы является исследование 30 парных проб сыворотки крови, взятых от крупного рогатого скота Новосибирской области в начале и в конце заболевания (с промежутком в 21 день), на наличие прироста титров вируснейтрализующих антител к вирусу ВД-БС КРС для установления этиологической роли данного вируса в заболевании.

   Постановку реакции нейтрализации осуществляли микрометодом с использованием 96-луночных плоскодонных культуральных планшетов трех фирм (ТРР и планшетов еще 2-х производителей культурального пластика) для проведения сравнительной оценки качества и удобства использования их в работе.

   Ранее серологическая диагностика ВД-БС КРС в России представляла собой длительную процедуру, основанную на постановке реакции нейтрализации макрометодом (с использованием стеклянных пробирок объемом 15 см3) в первично-трипсинизированных культурах клеток, которые получают путем дробления органов телят (почки, тестикулы) с помощью фермента трипсина. Данный способ постановки реакции имеет ряд недостатков, к которым относятся: 1) трудоемкий процесс получения первично-трипсинизированных культур клеток, 2) большой объем расходования питательных сред, 3) длительность постановки и учета реакции, 4) возможность контаминации культур клеток антителами или нецитопатогенными вирусами.

  

   В нашей лаборатории была усовершенствована методика постановки реакции нейтрализации микрометодом в перевиваемой культуре клеток КСТ (коронарные сосуды эмбриона коровы), чувствительной к действию вируса ВД-БС КРС. Использование 96-луночных плоскодонных культуральных планшетов позволило сократить объем расходования питательных сред для реакции и увеличить количество исследуемых проб.

   Исследовали 30 парных проб сыворотки крови крупного рогатого скота на наличие вируснейтрализующих антител. Сыворотки прогревали на водяной бане при температуре 56°С в течение 30 минут с целью инактивации неспецифических ингибиторов. Затем готовили двукратные разведения каждой пробы от 1: 2 до 1: 1024 на питательной среде Игла МЕМ, в которые добавляли в равных объемах (по 50 мкл) 100 ТЦД50 (тканевая цитопатическая доза вируса, вызывающая гибель 50% клеток) вируса и инкубировали в течение 1 часа при 37ºС в условиях 5% СО2. Затем в каждую лунку вносили по 100 мкл суспензии культуры клеток КСТ в концентрации 3 × 105 , инкубировали при 37ºС в тех же условиях в течение 78 часов. Реакцию учитывали по мере развития цитопатического действия вируса (ЦПД – видимые изменения монослоя, сопровождающиеся гибелью клеток в результате размножения в них вируса) в контрольных лунках с зараженной культурой клеток без сыворотки крови от исследуемых животных. За титр вируснейтрализующих антител (ВНА) брали последнее разведение сыворотки, тормозящее на 50 % ЦПД вируса.

   В результате проведенных исследований из 30 проб сыворотки крови, взятых в начале заболевания, вируснейтрализующие антитела к вирусу ВД-БС КРС были выявлены в 8 (26,7%) пробах в титрах 1: 2 – 1: 4. Из 30 проб сыворотки крови, взятых от этих же животных через 21 день, выявили 26 (86,7%) положительных проб, значения титров антител составили 1: 4 – 1: 64.

   В результате четырех- и более кратный прирост титров антител выявили в 19 (63,3%) пробах сыворотки крови. Полученные данные подтверждают этиологическую роль вируса ВДБС КРС в возникновении заболевания.

   В работе использовали 96-луночные плоскодонные культуральные планшеты трех фирм. Ни один из них не уступает по качеству материала. Никто не скажет об этом лучше и красноречивее, чем сама живая система, мы лишь сухими научными фразами можем это передать – клетки свободно прикрепляются к поверхности, не испытывая дискомфорта, формируют равномерный монослой в положенные сроки.

 

Рисунок – плоскодонные культуральные планшеты фирмы ТРР и других производителей пластиковой посуды.

  

Если внимательно посмотреть на рисунок, то сразу бросается в глаза оригинальная желтая полоска, выполненная творческими дизайнерами при создании образа планшета. Ее приятный цвет радует глаз и поднимает настроение. Поскольку не все лабораторные работники отличаются хорошим зрением, вполне дополняют этот образ яркие черные, хорошо видимые невооруженным глазом латинские буквы и арабские цифры, чем не могут похвастаться два образца, расположенные ниже. Хорошо просматриваемые лунки, в которые удобно раскапывать жидкость, имеют два образца (верхний и нижний справа), что становиться явным преимуществом при больших объемах работ, когда от многообразия розового цвета культуральной питательной среды начинает рябить в глазах.   Следовательно, по удобству использования в работе выигрывает верхний образец. Однако не могу не отметить один незначительный недостаток у данного образца, который никоим образом не умаляет достоинств планшета. Если по случайности неправильно подписать маркером планшет на желтой полосе, стереть надпись спиртом уже не получится, как на других, расположенных на рисунке снизу. Значимость данного недостатка в процентах составляет 0,01%. Использование в работе данного образца нас полностью удовлетворяет, и мы рекомендуем его всем.

Это интересно!

Лось может почувствовать как муха садится на его рога.

Корзина

Итоговая сумма:   0.00 Руб.
В корзину
www.noykem.ru
lab@ noykem.ru
(499) 346-39-14, (495) 77-46-319
(383) 363-85-90 (многоканальный)
(383) 332-80-42, 332-41-37


Copyright (с) 2013 - 2017 ООО "Нойкем"