Инфекционный ринотрахеит крупного рогатого скота (ИРТ КРС) нередкая проблема для животноводства нашей страны. Эта вирусная болезнь характеризуется острым течением, лихорадкой, общим угнетением, различными поражениями дыхательного тракта, половых органов и абортами.
Заболевание регистрируется во всех странах мира. В России оно также получило широкое распространение. Актуальность этой проблемы особенно возросла в последние годы. Это связано с завозом племенного скота из других стран в хозяйства РФ.
Возбудителем болезни является ДНК-геномный вирус, принадлежащий к семейству Herpetoviridae, роду Herpesvirus I.
В лабораторных условиях вирус ИРТ КРС культивируют с различными целями: производство вакцин и сывороток, использование вируса в реакции нейтрализации для выявления антител в сыворотках крови и в качестве положительного контроля в различных диагностических реакциях. Поэтому особенно важно найти наиболее простой и эффективный способ его культивирования.
Вирус ИРТ КРС можно культивировать на куриных эмбрионах, первично-трипсинизированных, диплоидных, перевиваемых линиях клеток, полученных от разных видов животных.
Цель нашего исследования – культивирование вируса ИРТ КРС в перевиваемой культуре клеток почки теленка - MDBK, используя пластик различных фирм.
Для осуществления данной работы использовали вакцинный штамм ТК-А вируса ИРТ КРС, который выращивали в перевиваемой культуре клеток почки теленка (MDBK). Для этого использовали питательную среду Игла МЕМ. К ней добавляли раствор канамицина для подавления роста бактериальной микрофлоры, а также аминокислоту L-глутамин. В случаях, когда требовалась ростовая среда, к среде Игла МЕМ также добавляли фетальную сыворотку фирмы «BioClot» 5-10% от общего объема. Для пересева культур клеток использовали 0,02% раствор Версена с 0,25% раствором трипсина в соотношении 9:1.
В процессе работы были использованы культуральные флаконы с поверхностью роста 25 см2 и 96-луночные планшеты фирм «TPP» и аналогичная посуда другого производителя.
Рисунок 1 - Культура клеток во флаконах разных фирм
Выращивание перевиваемой культуры клеток MDBK осуществлялось в стерильном боксе. Культуры клеток инкубировали в термостате при температуре 37 ºС. Монослой образовывался через сутки.
Рисунок 2 - Культура клеток MDBK под микроскопом
Пересев культуры клеток осуществляли раз в неделю. Для этого из флаконов сливали питательную среду, ополаскивали монослой культуры клеток раствором Версена и затем добавляли раствор Версена с трипсином (9:1). Когда клетки монослоя набухали (что наблюдалось невооруженным глазом при просмотре стенки флакона на свет) смесь сливали, а во флакон с культурой клеток добавляли небольшое количество питательной среды. Затем осторожно встряхивали флакон, в результате чего клетки отделялись от пластика. Добавляли необходимое количество питательной среды, до определенной концентрации клеток. Распределяли полученный материал на несколько флаконов, добавляли сыворотку и продолжали выращивать культуру клеток в термостате при температуре 37ºС.
Для заражения из флакона с монослоем культуры клеток сливали ростовую среду, добавляли 0,5 см3 вируса и 10 см3 питательной среды. Зараженную культуру инкубировали в термостате при температуре 37ºС, микроскопируя монослой клеток каждый час. Было произведено 3 последовательных пассажа вируса. При первом пассаже цитопатическое действие (ЦПД) вируса стало хорошо заметно через 48 часов: появились многоядерные клетки и клетки с вакуолями в цитоплазме, отдельные клетки приобрели более темную окраску на общем фоне, а затем стали округляться и отделяться от пластика группами по несколько клеток - в виде «гроздьев винограда». Во втором и третьем пассажах время проявления цитопатического действия заметно сократилось – изменения в монослое наблюдались уже через 6 часов.
Рисунок 3 - Цитопатическое действие вируса ИРТ КРС в культуре клеток
Активность вируса определяли путем титрования. В лунки 96-луночного планшета, в 4 параллельных ряда вносили культуру клеток по 0,05 см3, а затем добавляли вирус по 0,05 см3 в разведении: от 10-1 до 10-7. Затем планшеты помещали в термостат при 37оС и 5% СО2. Результат учитывали через 7 суток. Инфекционная активность вируса составила 5,75 lg ТЦД 50/0,1 см3.
Таким образом, для культивирования вируса ИРТ КРС в лабораторных условиях хорошо подходит перевиваемая культура клеток MDBK. В проведенных исследованиях достаточно быстро после заражения культуры проявлялось ЦПД вируса.
Для проведения подобной работы оказался пригодным пластик обеих фирм. Но личное предпочтение я бы отдала посуде фирмы «TPP». Несмотря на то, что первое время культура клеток привыкала к новому пластику, из-за чего её рост замедлился, она быстро адаптировалась и уже в третьем пассаже скорость её роста не уступала обычной. Во время пересева культуры клетки легко отделялись от стенки флакона, что значительно облегчило работу. Кроме того, у посуды этой фирмы оказалась очень удобная маркировка.