Россия

lab@ noykem.ru

Москва: (499) 346-39-14,  (495) 77-46-319   Новосибирск: (383) 363-85-90 (многоканальный), 332-80-42, 332-41-37

Наша задача - обеспечивать Ваши лаборатории качественной продукцией

Автор: 
Никонова Анастасия Александровна (студент)
Организация: 
Новосибирский государственный аграрный университет, факультет ветеринарии, г. Новосибирск
 
Конкурсная работа: 

   Инфекционный  ринотрахеит  крупного  рогатого  скота (ИРТ  КРС)  нередкая  проблема  для животноводства  нашей  страны. Эта  вирусная  болезнь характеризуется  острым  течением,  лихорадкой,  общим  угнетением,  различными поражениями дыхательного тракта,  половых органов  и абортами.
   Заболевание регистрируется во всех странах мира. В России оно также получило широкое распространение. Актуальность этой проблемы особенно возросла в последние годы. Это  связано с завозом племенного скота из других стран в хозяйства РФ.
   Возбудителем болезни является ДНК-геномный вирус, принадлежащий к семейству Herpetoviridae, роду Herpesvirus I.
   В лабораторных условиях вирус ИРТ КРС культивируют с различными целями: производство вакцин и сывороток, использование вируса в реакции нейтрализации для выявления  антител в  сыворотках крови и в качестве положительного  контроля  в  различных  диагностических  реакциях.  Поэтому особенно важно найти наиболее простой и эффективный способ его культивирования.
   Вирус ИРТ КРС  можно  культивировать  на  куриных  эмбрионах,  первично-трипсинизированных, диплоидных, перевиваемых  линиях  клеток,  полученных от разных видов животных.  
  

Цель нашего исследования – культивирование вируса ИРТ КРС в перевиваемой культуре клеток почки теленка - MDBK, используя пластик различных фирм.
   Для  осуществления  данной  работы  использовали  вакцинный  штамм ТК-А вируса ИРТ КРС, который выращивали в перевиваемой культуре клеток почки теленка (MDBK). Для этого использовали питательную среду Игла МЕМ.  К  ней  добавляли  раствор  канамицина для  подавления  роста  бактериальной  микрофлоры,  а  также  аминокислоту L-глутамин. В случаях,  когда  требовалась  ростовая  среда,  к среде Игла МЕМ также добавляли фетальную сыворотку фирмы «BioClot» 5-10% от общего объема. Для пересева культур клеток использовали 0,02%  раствор  Версена   с 0,25%  раствором трипсина в соотношении 9:1.
  В процессе работы были использованы культуральные флаконы с поверхностью роста 25  см2  и 96-луночные  планшеты  фирм «TPP» и аналогичная посуда другого производителя.

Культура  клеток во флаконах разных фирм

 Рисунок 1 -   Культура  клеток во флаконах разных фирм

  

Выращивание  перевиваемой  культуры клеток MDBK  осуществлялось  в  стерильном боксе.  Культуры  клеток  инкубировали  в термостате  при  температуре 37 ºС.  Монослой образовывался через сутки.

Культура клеток MDBK под микроскопом

Рисунок 2  - Культура клеток MDBK под микроскопом

  

Пересев культуры клеток осуществляли   раз  в  неделю.  Для  этого  из  флаконов сливали  питательную  среду,  ополаскивали монослой  культуры  клеток  раствором  Версена  и  затем  добавляли  раствор  Версена  с трипсином (9:1). Когда клетки монослоя набухали (что  наблюдалось  невооруженным глазом  при  просмотре  стенки  флакона  на свет)  смесь  сливали,  а  во флакон  с  культурой  клеток  добавляли  небольшое  количество  питательной  среды.  Затем  осторожно встряхивали флакон, в результате чего клетки отделялись от пластика.  Добавляли необходимое количество питательной среды, до определенной концентрации клеток. Распределяли полученный материал на несколько флаконов,  добавляли сыворотку и продолжали выращивать культуру клеток в термостате при температуре 37ºС.  
   Для заражения из флакона с монослоем культуры клеток сливали ростовую  среду,  добавляли 0,5  см3  вируса  и 10  см3 питательной  среды.  Зараженную культуру инкубировали в термостате при температуре 37ºС, микроскопируя монослой клеток каждый час. Было произведено 3 последовательных  пассажа  вируса. При  первом  пассаже цитопатическое  действие (ЦПД)  вируса стало хорошо заметно через 48 часов: появились  многоядерные  клетки  и  клетки  с вакуолями в цитоплазме, отдельные клетки приобрели  более  темную  окраску  на  общем фоне, а затем стали округляться и отделяться  от  пластика  группами  по  несколько клеток - в виде «гроздьев винограда». Во  втором  и  третьем  пассажах  время проявления  цитопатического  действия  заметно сократилось – изменения в монослое наблюдались уже через 6 часов.

Цитопатическое действие вируса ИРТ КРС в культуре клеток

Рисунок 3 - Цитопатическое действие вируса ИРТ КРС в культуре клеток  

 

Активность  вируса  определяли  путем  титрования.  В  лунки 96-луночного планшета, в 4 параллельных ряда вносили культуру клеток по 0,05 см3, а затем добавляли вирус  по 0,05 см3 в разведении:  от 10-1 до 10-7.  Затем планшеты помещали в термостат при 37оС и 5% СО2. Результат учитывали через 7 суток. Инфекционная активность вируса составила 5,75 lg ТЦД 50/0,1 см3.
  

  

Таким образом, для культивирования вируса ИРТ КРС в лабораторных условиях хорошо подходит перевиваемая  культура  клеток MDBK. В проведенных исследованиях достаточно быстро после заражения культуры проявлялось ЦПД вируса.  
   Для  проведения  подобной  работы  оказался  пригодным  пластик  обеих фирм. Но личное предпочтение я бы отдала посуде фирмы «TPP». Несмотря на то, что первое время культура клеток привыкала к новому пластику, из-за чего её рост замедлился, она быстро адаптировалась и уже в третьем пассаже скорость её роста не уступала обычной. Во время пересева культуры клетки легко  отделялись  от  стенки  флакона,  что  значительно  облегчило  работу. Кроме того, у посуды этой фирмы оказалась очень удобная маркировка.

Это интересно!

Головастики южноамериканской парадоксальной лягушки больше чем сама лягушка!

Корзина

Итоговая сумма:   0.00 Руб.
В корзину
www.noykem.ru
lab@ noykem.ru
(499) 346-39-14, (495) 77-46-319
(383) 363-85-90 (многоканальный)
(383) 332-80-42, 332-41-37


Copyright (с) 2013 - 2017 ООО "Нойкем"