Россия

lab@ noykem.ru

Москва: (499) 346-39-14,  (495) 77-46-319   Новосибирск: (383) 363-85-90 (многоканальный), 332-80-42, 332-41-37

Наша задача - обеспечивать Ваши лаборатории качественной продукцией

 

Автор: 
Ильчибаева Татьяна Витальевна (студент)
Организация: 
Институт цитологии и генетики СО РАН, лаборатория нейрогеномики поведения, г. Новосибирск
 
Конкурсная работа: 

   Прежде чем перейти к сути исследования, мне придётся сделать довольно большое введение. В общем, не так давно, в одной не очень далёкой галактике…

 

   …Все вы (ну или почти все) сталкивались с такой ситуацией: стоите в супермаркете, держите в руках батон и пакет кефира (либо пиво и «Кириешки», это кому что), и, казалось бы, никаких проблем, но прямо перед вами какая-то старушка трясущимися руками пытается пересчитать кучу мелочи. Эти минуты в очереди кажутся бесконечностью, и вас уже начинает одолевать самый настоящий гнев, но не спешите зеленеть от злости, ведь перед вами человек с болезнью Паркинсона (далее БП). На каждые 100 тысяч человек приходится от 65 до 140 больных паркинсонизмом. Это второе по распространённости нейродегенеративное заболевание (на первом месте синдром Альцгеймера) которое как было, так и остаётся неизлечимым. Причина паркинсонизма, – лютая смерть дофаминовых нейронов в чёрной субстанции и деградация дофаминовых путей в головном мозге. Причём симптомы болезни появляются только когда отмирает порядка 60-70% дофаминэргических нейронов. Это как торфяной пожар, – сначала его не видно, а потом ВНЕЗАПНО полыхает сильно и везде. Естественно, медицина не хотела и не хочет мириться с подобным безобразием. Однако, предотвращение БП это дело пока неосуществимое, и остаётся только лечить сие заболевание, насколько такое вообще возможно. Ещё в прошлом веке пациентам с паркинсонизмом начали вводить леводопу (диоксифенилаланин), – предшественник дофамина, призванный восполнить его убыль в поражённом мозге. Однако, при эффективности 50% и куче побочных эффектов, можно сказать, что леводопа, – это всё же фиговое лекарство от БП.

   Нынешним трендом в лечении нейродегенеративных заболеваний является нейровосстановление (neurorestoration), как эдакий комплексный подход, основанный на современных достижениях молекулярной и клеточной биологии. Немалое место в этом движении занимают нейротрофические факторы. Десять лет назад был открыт GDNF (glial cell line-derived neurotrophic factor; глия-производный нейротрофический фактор), небольшой такой белок, который, тем не менее, играет решающую роль в дифференцировке, поддержании и восстановлении дофаминовых нейронов (Lin et al., 1993). Сейчас совершенно очевидно, что нехватка GDNF сказывается на жизнедеятельности самым плачевным образом (Pascual et al., 2011), но уже тогда, в лохматых девяностых, стали видны перспективы использования данного нейротрофического фактора в качестве средства от БП. Сначала на животных моделях паркинсонизма (Grondin and Gash, 1998; Grondin et al., 2002), а потом уже и на человеке (Gill et al., 2003) GDNF продемонстрировал свою эффективность в восстановлении поражённых дофаминовых нейронов. Хотя введение GDNF (плохо преодолевающего гематоэнцефалический барьер) прямо в стриатум было сопряжено с риском тяжёлых осложнений (которые таки появились), некоторые улучшения всё же наблюдались (Gill et al., 2003). Помимо улучшения в двигательной сфере, наблюдались также улучшение памяти и настроения больных. А это уже может быть связано с другими моноаминэргическими системами мозга, а именно с серотониновой системой. Правда, тут мы сталкиваемся с крайним недостатком данных. Взаимодействие GDNF и серотониновой системы изучено плохо. Кое какие намётки конечно имеются. В частности известно, что GDNF способен активировать серотониновые нейроны у старых крыс (Pertusa et al., 2007), а серотонин в свою очередь способен усиливать экспрессию GDNF (Hisaoka et al., 2004). Данных мало, но есть над чем призадуматься и от чего оттолкнуться.

 

   Собственно нашей целью было изучение эффектов введения GDNF на экспрессию ключевых генов серотониновой системы мозга, как аспекта совершенно нераскрытого, но в то же время важного. Всё таки понимание молекулярных механизмов в нашу постгеномную эру, - дело первостепенной важности.

   Если уж мы рассматриваем гипотетический антидепресантный эффект GDNF, то и модель у нас должна быть соответствующая. Мы остановились на мышах линии ASC, проявляющих депрессивно-подобное поведение и признанных моделью депрессии (Kulikov et al., 1993). В левый боковой желудочек подопытных животных был введён рекомбинантный GDNF (для дотошных координаты AP: 0.5 мм, L: 1.6 мм, DV: 2 мм; по Slotnick and Leonard, 1975), контрольным животным ввели, соответственно, чистую стерильную воду. Процедура проводилась под анастезией. По истечении двух недель животные были декапитированы, структуры мозга изъяты и заморожены. Далее были выделение РНК, реакция обратной транскрипции и ПЦР-анализы…много ПЦР-анализов. На каждой стадии у нас под рукой были удобные штативы, криобоксы и центрифужные пробирки TPP. Продукция очень порадовала – устойчивые штативы и замечательные пробирки с четкой маркировкой – хотелось раскапывать и раскапывать растворы, выделение РНК пошло значительно быстрее!

   А вот криобоксы немного расстроили – одной ячейки как-то не хватало, ведь при стандартной выборке в 10 образцов, размеры 9х9 ячеек принуждают либо ставить всё сплошняком (что при работе с кДНК совсем не помогает) либо неэргономично использовать место (дабы аккуратно разместить в нужном порядке образцы из разных выборок).

   Плюс крышка, которую оказалось очень затруднительно снять одной рукой, если в другой руке зажаты образцы: к этому пришлось привыкать...

   Я не стану углубляться в описание используемого нами метода количественного ОТ-ПЦР, ибо он хорошо описан в целом ряде публикаций (Науменко, Куликов, 2006; Kulikov et al., 2005, Naumenko et al., 2008), и побыстрее перейду к собственно результатам.

 

  Что же мы в итоге получили?

   В головном мозге за синтез серотонина отвечает только один фермент – триптофан гидроксилаза-2 (Tph2) и экспрессия гена, кодирующего данный фермент оказалась повышенной у животных получавших GDNF (рис 1). Tph2 принят чувствительным маркёром функциональной активности 5-НТ системы, а по сему изменения в экспрессии данного фермента уже о многом говорят.

Рис.1. Уровень экспрессии гена, кодирующего Tph2. Экспрессия представлена как число копий кДНК гена на 100 копий кДНК ГФД (референсный ген).** Р<0,01

 

   Не менее интересные результаты мы получили по экспрессии гена, кодирующего 5-НТ1А рецептор. Из всех подтипов 5-НТ рецепторов (коих насчитывается 14), 1А рецептор наиболее важный и полифункциональный. Важность данного рецептора во многом обусловлена его умением ауторегулировать активность серотониновых нейронов. Ауторецепторы, обильно гнездящиеся на телах и дендритах серотонергических нейронов, встречаются исключительно в ядрах шва среднего мозга, и мы имели радость наблюдать повышение их экспрессии (рис 2).

Рис.2. Уровень экспрессии гена, кодирующего 5-HT1A рецептор. Экспрессия представлена как число копий кДНК гена на 100 копий кДНК ГФД (референсный ген).*P<0,05; ** Р<0,01

Рис.3. Уровень экспрессии гена, кодирующего 5-НТ2А рецептор. Экспрессия представлена как число копий кДНК гена на 100 копий кДНК ГФД (референсный ген).** Р<0,01.

 

   В тоже время, экспрессия постсинаптических 1А гетерорецепторов в гиппокампе снизилась. Удивительного в этом ничего нет, ибо ауторецепторы и гетерорецепторы различаются по экспрессии и в нативном мозге. Сопряжены они видимо с различными G-белками, да и регуляция транскрипции осуществляется разными сайленсерами.

   У всех депрессивных больных экспрессия 5-НТ2А рецептора снижена (это же касается и наших мышек ASC). И это не есть хорошо, ибо 2А рецепторы отвечают за серотонергический контроль эмоциональной сферы (это грубо говоря, конечно), и в большом количестве расположены в пирамидальных структурах префронтальной коры. Тот факт, что GDNF поспособствовал усилению экспрессии данных рецепторов, даёт нам право предполагать антидепрессантный эффект.

   Нами рассматривался так же транспортёр серотонина (5-НТТ), тот, что затягивает выброшенный серотонин обратно в пресинаптическое окончание для рециклинга. Однако тут мы никаких достоверных изменений в экспрессии не обнаружили…что, впрочем, нас совсем не печалит.

   Т.о., подводя жирную черту под всем вышесказанным и показанным, я могу сказать, что мы идём верной дорогой. Взаимодействие GDNF и серотониновой системы ещё более сильное, чем мы предполагали, и реализуется даже на уровне экспрессии генов. Двигаясь дальше в этом ключе мы, возможно, более полно поймём весь спектр и глубину терапевтических эффектов GDNF.

Это интересно!

Самка камышовой жабы откладывает икринки в виде шнуров длиной до 3 метров...

Корзина

Итоговая сумма:   0.00 Руб.
В корзину
www.noykem.ru
lab@ noykem.ru
(499) 346-39-14, (495) 77-46-319
(383) 363-85-90 (многоканальный)
(383) 332-80-42, 332-41-37


Copyright (с) 2013 - 2017 ООО "Нойкем"