Во всем мире клеточные технологии широко применяются в регенеративной медицине наряду со стандартными методами лечения. Кроме ГСК и клеток кожи широко используются также и мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки (МСК). В силу своих уникальных свойств, в первую очередь способности дифференцироваться в различных направлениях, МСК привлекают внимание большого количества исследователей и врачей. Наряду с костным мозгом в качестве основного источника МСК все чаще рассматривается жировая ткань в связи с ее доступностью.
Целью данной работы было получить и охарактеризовать МСК из жировой ткани здорового донора после длительного культивирования.
Материалы и методы.
Образцы подкожной жировой клетчатки были получены в ходе плановой косметологической операции (липосакции), обработаны механическим способом. Затем их подвергали действию коллагеназы (Sigma). Диссоциированные клетки центрифугировали в пробирках объемом 50 мл (ТРР) и рассевали на культуральные флаконы (ТРР).
Культивирование клеток проводили на среде аМЕМ (Sigma) с добавлением 20% телячьей сыворотки (HyClone) и ростового фактора FGFb (HyClone). Морфологию клеток оценивали с помощью инвертированного микроскопа (Olympus). Фенотипирование клеток проводили с использованием антител к CD34, CD90, CD105, CD73, HLA DR, CD271, CD14 и CD45 методом проточной цитометрии.
Результаты.
В течение всего времени культивирования (около 3,5 недель) на культуральном пластике клетки чувствовали себя прекрасно. МСК проявляли свойства и фенотип, характерный для данного типа клеток. Морфология клеток – фибробластоподобная (рис. 1). За 3 недели клетки прошли 4 пассажа, их количество увеличилось примерно в 50 раз, что говорит о хороших условиях культивирования, и в том числе о качественной подложке.
Рис. 1. МСК на следующий день после пересева.
После культивирования, клетки показали соответствие фенотипу МСК, что было оценено с помощью антител к CD34, CD90, CD105, CD73, HLA DR, CD271, CD14 и CD45 методом проточной цитометрии (табл. 1).
Маркер | Количество клеток, % |
CD45 | 0,5 % |
CD34 | 12,1% |
CD14 | 2,6% |
HLA-DR | 8,9% |
CD73 | 100% |
CD105 | 99,6% |
CD90 | 100% |
Таблица 1. Результаты фенотипирования клеток.
Как видно из табл. 1 и рис. 2, более 99% клеток окрашивались антителами к CD73, CD90 и CD105, которые являются поверхностными маркерами мезенхимальных стволовых клеток. В то же время лишь небольшое количество клеток характеризовались наличием CD45 и 14 – маркеров гемапоэтических клеток. По данным разных авторов у МСК, выделенных из жировой ткани, процент клеток, несущих маркер CD34, сильно варьирует. В нашем случае таких клеток в популяции было около 12%.
a | b |
c |
Рис. 2. Результаты проточной цитометрии МСК при окрашивании клеток антителами к поверхностным маркерам:
|
Выводы.
На основании полученных данных можно утверждать, что МСК при длительном культивировании на пластике фирмы ТРР (Швейцария) проявляют свойственный им фенотип и имеют характерную для данного типа клеток морфологию.