Россия

lab@ noykem.ru

Москва: (499) 346-39-14,  (495) 77-46-319   Новосибирск: (383) 363-85-90 (многоканальный), 332-80-42, 332-41-37

Наша задача - обеспечивать Ваши лаборатории качественной продукцией

 

Автор: 
Борода Андрей Викторович (научный сотрудник)
Организация: 
Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биологии моря им. А.В. Жирмунского Дальневосточного отделения Российской академии наук, лаборатория клеточных технологий, г. Владивосток
 
Конкурсная работа: 

 

   Криоконсервация клеток личинок и целых эмбрионов – один из перспективных путей сохранения генофонда промысловых, а также редких и исчезающих видов животных и растений. Актуальность развития методов криоконсервации клеток морских гидробионтов определяется не только необходимостью сохранения генофонда морских организмов в условиях усиливающегося антропогенного воздействия на Мировой океан, но и связана с потенциальной возможностью работы с эмбрионами и клетками этих объектов в течение всего года. На основании полученных данных будут разработаны новые технологии, необходимые для создания современного Криобанка морских гидробионтов. Различия в структуре и функции клеток являются причиной их неодинаковой реакции на низкую температуру, поэтому метод замораживания–оттаивания, разработанный для клеток одного вида, зачастую нельзя использовать для клеток других видов организмов.

 

   Была изучена токсичность отдельных криозащитных соединений и эффективность их введения в криопротекторные смеси для замораживания личинок и клеток морских беспозвоночных и клеток морских микроводорослей. Исследованы морфофункциональные изменения, происходящие с клетками морских гидробионтов на различных стадиях замораживания. Критериями оценки был анализ жизнеспособности замораживаемых клеток и личинок, морфологии, функциональной активности (оценка уровня активности митохондриальных ферментов, способность клеток к пролиферации и дифференцировке в культуре, содержание отдельных пигментов в клетках водорослей). Разработаны оптимальные режимы замораживания для определенных видов гидробионтов.

   Для сохранения клеток морских беспозвоночных животных нами предложен подход, основанный на использовании биологически активных веществ из тканей морских организмов (липидных экстрактов, гликопептидов и антиоксидантов). Установлен синергизм действия этих компонентов криозащитных смесей, но обнаружена специфичность действия антиоксидантов в зависимости от вида организма. Проведен анализ факторов, определяющих выбор криопротекторов для различных типов клеток.

   Мы проанализировали морфофункциональные изменения клеток личинок морского двустворчатого моллюска Mytilus trossulus до и после замораживания-оттаивания in vitro. Только жизнеспособные и функционально активные клетки мидии способны распластываться и сокращаться в культуре (рис. 1A). Клетки, замороженные в присутствии диметилсульфоксида, трегалозы, экзогенных липидов и антиоксидантов прикреплялись к субстрату и «распластывались» на нем, формируя многочисленные отростки, в течение 12 часов после оттаивания (рис. 1С). По морфологии они напоминали контрольные клетки до замораживания, что нельзя сказать о клетках, замороженных в присутствии только диметилсульфоксида и трегалозы, которые имели округлую форму и не закреплялись на субстрате (рис. 1B). Более того, распластанные клетки уже через сутки культивирования начинали спонтанно сокращаться, что несомненно говорит о восстановлении их функциональной активности.


   

Рис. 1. Клетки трохофоры мидии Mytilus trossulus в культуре. А – интактные клетки, 24 ч в культуре; B–C – клетки после замораживания – оттаивания: в присутствии диметилсульфоксида и трегалозы, 24 ч культивирования (B); в присутствии диметилсульфоксида, трегалозы, экзогенных липидов, витаминов С и Е, 24 ч в культуре. Масштабная линейка – 50 мкм.

 

   Положительный эффект тестируемых антиоксидантов (витаминов Е и С, эхинохрома) был установлен только в присутствии экзогенных липидов. После замораживания клеток эмбрионов трех видов морских ежей (Strongylocentrotus intermedius, S. nudus, Scaphechinus mirabilis) в криопротекторной среде, содержащей трегалозу, липидный экстракт из тканей мидии и эхинохром, процент жизнеспособных клеток достигал 75-80%. Клетки после оттаивания закреплялись на субстрате, некоторые синтезировали пигментные гранулы и спикулы, часть клеток агрегировала, образуя эмбриоиды, которые активно двигались в течение 5–14 суток (рис. 2).

Рис. 2. Клетки плавающей бластулы морского ежа Strongylocentrotus intermedius в культуре. А – интактные клетки, 24 ч в культуре; B–E – клетки после замораживания – оттаивания: в присутствии трегалозы и эхинохрома, 24 ч (B) и 120 ч (C, D) культивирования; E – в присутствии трегалозы и экзогенных липидов, 96 ч в культуре. Масштабная линейка – 100 мкм.

 

   На рис. 3 представлен внешний вид крупной морской диатомовой водоросли Attheya ussurensis до (рис. 3А) и после замораживания в присутствии двух типов криопротекторов – трегалозы (рис. 3Б) и ДМСО (рис. 3В). Показателем нормального состояния этой микроводоросли является наличие яркоокрашенного расправленного хлоропласта в клетках. После оттаивания клетки с такими хлоропластами появляются через 10-14 суток в случае, когда они были заморожены в присутствии трегалозы, и только через 28 суток, когда в качестве криопротектора был использован ДМСО.


   

Рис. 3. Клетки морской диатомовой водоросли Attheya ussurensis до замораживания (А) и после замораживания в присутствии трегалозы (B) и ДМСО (C). Появление клеток с ярко-окрашенными хлоропластами через 14 суток (B) и через 28 суток (C) после оттаивания. Масштабная линейка 20 мкм.

 

Использовали следующий пластик фирмы TPP.

 

Криопробирки (1.2, 2.0, 4.5 мл):

- Достоинства. Удобная коническая форма дна позволяет «до капли» собрать суспензию клеток. Крышка плотно завинчивается даже без дополнительного силиконового уплотнения. Благодаря зубчатому основанию и соответствующему фиксатору в штативе TPP манипуляции по закручиванию/откручиванию крышки можно осуществлять одной рукой, что немаловажно при большом количестве образцов, нехватке времени и свободных конечностей. Наружная маркировка не закрывает основную часть пробирки, позволяя «на глаз» оценить количество клеток, уцелевших после замораживания-оттаивания.

- Замеченные недостатки. Один из этапов замораживания клеток в наших экспериментах включает инкубацию в низкотемпературном термостате (-25 – -30°C), когда криопробирки погружены в раствор этиленгликоля и этанола (в течение 20 – 40 минут), далее следует замораживание в жидком азоте. При оттаивании на водяной бане (+20°C) с большинства криопробирок отпадает вся оригинальная наружная маркировка, рассыпаясь на мелкие кусочки.

- Предложения по улучшению. Криопробирки объемом 1.2 мл стоило бы сделать в 1.5 – 2 раза выше и соответственно уменьшить их диаметр, чтобы увеличить площадь соприкосновения содержимого, что немаловажно для достижения высоких скоростей замораживания, а также для удобства манипуляций с криопробиркой – на данный момент криопробирки слишком низкие, что иногда бывает неудобным. Оригинальное зубчатое основание стоило бы также сделать выше у криопробирок любого объема, чтобы плотно держать за него криопробирку, а не за «тело» пробирки, что нагревает ее содержимое – это необходимо, когда, например, манипуляции проводят на ледяной бане и любой незначительный нагрев нежелателен.

 

Центрифужные пробирки (15, 50 мл):

- Достоинства. Вполне классические конические пробирки, но имеют более удобный шаг резьбы, позволяющий за меньшее количество оборотов открыть пробирку. Широкое поле для маркировки. Почти не стирающаяся шкала объема, благодаря которой «одноразовые» пробирки даже после 10 раз использования вполне презентабельны.

- За 3 года использования недостатков не обнаружено.

 

Планшеты культуральные с крышкой, 24 лунки, плоское дно:

- Достоинства. Пластик качественный и очень прозрачный.

- Недостатков не обнаружено.

 

Штативы для центрифужных пробирок и криопробирок:

- Достоинства. Компактные, удобные, ничего лишнего.

- Недостатков не обнаружено.

 

Это интересно!

Стрижи спят в полёте.

Корзина

Итоговая сумма:   0.00 Руб.
В корзину
www.noykem.ru
lab@ noykem.ru
(499) 346-39-14, (495) 77-46-319
(383) 363-85-90 (многоканальный)
(383) 332-80-42, 332-41-37


Copyright (с) 2013 - 2017 ООО "Нойкем"