Россия

lab@ noykem.ru

Москва: (499) 346-39-14,  (495) 77-46-319   Новосибирск: (383) 363-85-90 (многоканальный), 332-80-42, 332-41-37

Наша задача - обеспечивать Ваши лаборатории качественной продукцией

Автор: 
Лыков Александр Петрович (ведущий научный сотрудник), совместно с Бондаренко Н.А., Ким И.И., Повещенко О.В.
Организация: 
Федеральное государственное бюджетное учреждение "НИИ клинической и экспериментальной лимфологии" Сибирского отделения Российской академии медицинских наук, лаборатория лимфотропной терапии и лимфодиагностики, г. Новосибирск
 
Конкурсная работа: 

Одним из свойств, клеточных культур является их способность  прилипать к стеклу/пластику и  расти на нем.  Известно, что на способность к адгезии/росту на пластике влияет его молекулярный состав и их пространственная конфигурация, приводящие к усилению или снижению адгезии/росту клеточных культур (Hirano S., 1999; Jacobson B.S., 1982; Shahar A., 1990; Triglia T., 1985). 

   Цель исследования: оценка функциональной активности клеток эндотелиальной линии EA.Hy926 при культивировании на пластике фирмы TPP (Швейцария)  и на аналогичном пластике другого производителя.

  

   Материалы и методики исследования. Исследования производились на клетках эндотелиальной линии EA.Hy926, любезно предоставленной Dr. C.J. Edgel (Университет Каролины, США). Культура клеток была получена гибридизацией первичной эндотелиальной линии HUVEC с клетками карциномы легкого А-549.  Для клеток эндотелиальной линии EA.Hy926 характерно сохранение основных морфологических, фенотипических и функциональных свойств, присущих клетками эндотелия макрососудов. Культивирование клеток эндотелиальной линии EA.Hy926 проводили в питательной среде DMEM/F12 с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки (Биолот, Россия), 160 мкг/мл гентамицин сульфата (Дальхимфарм, Россия), 2 ммоль L-глютамина (ICN, США) и HAT, добавку к среде, содержащую гипоксантин, аминоптерин и тимидин (ICN, США). Клетки культивировали в плоскодонных матрацах для прилипающих культур в концентрации 1,7 х 105 клеток/мл при 370С во влажной атмосфере с 5% содержания СО2 до образования конфлюэнтного монослоя. Пересев осуществляли 1 раз в 3-4 дня по общепринятой методике, вызывая дезинтеграцию монослоя 5-10-минутной экспозицией в растворе Версена (Биолот, Россия). В работе использовали пластиковые матрацы (TPP, Швейцария  и аналоги другого производителя). Влияние пластика на функциональные свойства клеток эндотелиальной линии EA.Hy926 изучали по пролиферативной активности, оцениваемой по выходу клеток на 3-4 сутки культивирования в культуральных флаконах  и жизнеспособности клеток по окрашиванию витальным красителем  (трипановый синий; Sigma, США), а также на спектрофотометре (Stat Fax 2100, США) при длине волны 492 нм по включению клетками (10 000/лунку; в триплетах) 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенил-2Н-тетразолиум бромида (МТТ) и преобразования его в формазан митохондриальными дегидрогеназами (Liu J., 2010; Lee C.C., 2006); полученные значения выражали в единицах оптической плотности (ед. опт. пл.). Уровни метаболитов оксида азота (NO) определяли на спектрофотометре с использованием реактива Griess  при длине волны 540 нм (Кондрашова Н.М., 2010). Кинетику роста клеток эндотелиальной линии EA.Hy926 исследовали на микроскопе (Olympus CKX41SF, Япония) при 4 кратном увеличении. Статистическую обработку данных проводили с использованием пакета программ Statistica 6,0 (StatSoft, USA). Данные представляли в виде медианы (Me), достоверность различий рассчитывали по U-критерию Манна-Уитни, и принималась при значениях p<0,05.

  

   Результаты исследования. Необходимо отметить тот, что как при культивировании клеток эндотелиальной линии EA.Hy926 на пластике TPP (Швейцария), так и  при культивировании клеток эндотелиальной линии EA.Hy926 на пластике другого производителя, нами была отмечена закономерность снижения выхода клеток.  Однако, не смотря на общую тенденцию к снижению выхода клеток эндотелиальной линии EA.Hy926, в случае роста клеток на пластике фирмы TPP (Швейцария) нами отмечено статистически значимо больший выход клеток по сравнению с выходом клеток культивируемых на пластике другого производителя.

Рисунок 1. Динамика выхода клеток эндотелиальной линии EA.Hy926  с учетом культивирования на пластике фирм (TPP, Швейцария и аналогичная посуда другого производителя).

  

   Как видно из рисунка 2, показатель выхода жизнеспособных клеток эндотелиальной линии EA.Hy926 на пластике фирмы TPP (Швейцария) всегда превышал 70%.

Рисунок 2. Динамика жизнеспособности клеток эндотелиальной линии EA.Hy926  с учетом культивирования на пластике фирм (TPP, Швейцария  и аналогичная посуда другого производителя).

 

Количественные показатели выхода клеток эндотелиальной линии EA.Hy926 и жизнеспособность их при культивировании на пластике фирмы TPP (Швейцария) и на аналогичном пластике другого производителя представлены в таблице 1.

            Таблица 1. Количество и процент жизнеспособности клеток эндотелиальной линии EA.Hy926. (Me; Lq-Hq / Min-Max).

Культуральный пластик производителя

Выход клеток (106/мл)

Показатель жизнеспособности (в %)

TPP (Швейцария)

1,50 (1,42-1,62  / 1,35-2,50)

Pu=0,00075

88,00 (8-,35-94,50 / 72,70-98,00)

Pu=0,000778

Пластик другого производителя

0,75 (0,50-0,95 / 0,30-1,05)

54,05 (48,00-57,50 / 17,00-66,70)

Примечание: Pu – достоверность различий по Манн-Уитни.

 

   Как видно из таблицы, средний выход клеток эндотелиальной линии EA.Hy926 и ее жизнеспособность при культивировании на пластике фирмы TPP (Швейцария) были статистически значимо большими, по сравнению с аналогом.

   

   Объективным доказательством условий для культивирования прилипающей клеточной эндотелиальной линии EA.Hy926  является плотность роста данной линии, оцениваемой визуально при микроскопии.

   Так нами при исследовании морфологических признаков клеток эндотелиальной линии EA.Hy926 на микроскопе отмечается сохранность веретенообразной структуры клеток при культивировании их на пластике обеих фирм (Рис. 3 и 4).

Рисунок 3. Плотность роста клеток эндотелиальной линии EA.Hy926 на пластике фирмы TPP (Швейцария) (4х).

   Как видно на рисунке 3, клетки эндотелиальной линии EA.Hy926  имеют веретенообразную форму, цитоплазма однородной формы, клетки заполнили все свободное пространство, и имеет место конфлюэнтность роста клеток эндотелиальной линии EA.Hy926.

Рисунок 4. Плотность роста клеток эндотелиальной линии EA.Hy926 на пластике другого производителя (4х).

   Необходимо отметить то, что при росте клеток на этом пластике имело место наличие больших пространств дна флакона, свободных от клеток, а также отсутствовала конфлюэнтность между растущими клетками (Рис. 4). Также в клетках эндотелиальной линии EA.Hy926 выращенных на исследуемом пластике отмечаются заметные изменения в структуре цитоплазмы клеток, появление вакуолей и формирование глыбчатых структур.

 

   Кроме этого, нами была исследовано влияние культурального пластика на пролиферативный потенциал клеток эндотелиальной линии EA.Hy926  по включению МТТ in vitro (Рис. 5 и 6).

   Установлено, что исходный уровень пролиферативной активности клеток эндотелиальной линии EA.Hy926, который оценивался по интенсивности включения МТТ,  сразу после снятия их с пластика - (базисный уровень) был статистически значимо большим для клеток эндотелиальной линии EA.Hy926 выращенных на пластике фирмы TPP (Швейцария) (p < 0,001).

Рисунок 5. Показатели исходного уровня пролиферативного потенциала клеток эндотелиальной линии EA.Hy926, оцениваемые в МТТ-тесте, сразу  после снятия клеток с культурального пластика (базисный уровень).

Рисунок 6. Показатели пролиферативного потенциала клеток эндотелиальной линии EA.Hy926, оцениваемые в МТТ-тесте, спустя 24 часа инкубации клеток в 96-луночных плоскодонных планшетах (индуцированный уровень).

 

   Что же касается пролиферативной активности оцениваемой спустя 24 часа инкубации клетки эндотелиальной линии EA.Hy926 полученные с культурального пластика фирмы TPP (Швейцария) давали дозозависимый характер поглощения МТТ, что является отражением более активных процессов деления клеток. (Рис. 6)

 

   Одним из показателей, характеризующим функциональную активность клеток является способность их продуцировать биологически активные вещества во внешнюю среду, в том числе и NO. Как видно из рисунка 7, при выращивании клеток на пластике фирмы TPP (Швейцария) уровень продукции NO был выше, чем при выращивании клеток на пластике другого производителя.

Рисунок 7. Содержание оксида азота в супернатанте клеток эндотелиальной линии EA.Hy926 с учетом культивирования на пластике различных фирм производителей.

 

Выводы:

1. Показано статистически значимо больший выход количества и жизнеспособности клеток эндотелиальной линии EA.Hy926 при культивировании на пластике фирмы TPP (Швейцария), по сравнению с аналогичными показателями в условиях роста клеток на пластике другого производителя.

2. Интенсивность пролиферативного потенциала в МТТ-тесте клеток культивированных на пластике фирмы TPP (Швейцария) статистически значимо выше, чем аналогичный показатель для клеток с культурального пластика другого производителя.

3. О сохранности функциональной активности клеток эндотелиальной линии EA.Hy926 можно судить по  продукции NO во внешнюю среду при  культивировании на пластике фирмы TPP (Швейцария).

 

Список цитируемой литературы:

1. Кондрашова Н.М. Клеточные факторы местной защиты при внебольничной пневмонии // Цитология. – 2010. – Т.52. - № 7. – С. 588-596.

2. Hirano S., Kanno S. Syk and paxillin are differentially phosphorylated following adhesion to the plastic substrate in rat alveolar macrophages // Immunology. – 1999. – Vol. 97. – P. 414-419.

3. Jacobson B.S., Ryan U.S. Growth of endothelial and HeLa cells on a new multipurpose microcarrier that is positive, negative or collagen coated // Tissue Cell. – 1982. – Vol. 14. – P. 69-83.

4.  Liu J., Uygur B., Zhang Z., Shao L., Romero D., Vary C., Ding Q., Wu W.S. Slug Inhibits Proliferation of Human Prostate Cancer Cells via Downregulation of Cyclin D1 Expression //  Prostate.  – 2010. – Vol. 70. – P. 1768–1777.

5. Lee C.C., Lin C.N., Jow G.M. Cytotoxic and apoptotic effects of prenylflavonoid artonin B in human acute lymphoblastic leukemia cells // Acta Pharmacologica Sinica. -  2006. – Vol.  27. – P. 1165–1174.

6. Shahar A., Reuveny S., David Y., Hamdorf G., Terborg M., Cervos-Navarro J. Selective adherence of neurons and glial cells from dissociated cerebral and spinal cord microcarrier cultures // J.  Biotechnol. – 1990. – Vol. 16. – P. 221-232.

7. Triglia T., Burns G.F., Werkmeister J.A. Rapid changes in surface antigen expression by blood monocytes cultured in suspension or adherent to plastic // Blood. – 1985. – Vol. 65. – P. 921 -928.

Это интересно!

Стволовые клетки ("stem cell") ― уникальный тип незрелых клеток, которые являются прародительницами всех клеток и тканей нашего организма.

Корзина

Итоговая сумма:   0.00 Руб.
В корзину
www.noykem.ru
lab@ noykem.ru
(499) 346-39-14, (495) 77-46-319
(383) 363-85-90 (многоканальный)
(383) 332-80-42, 332-41-37


Copyright (с) 2013 - 2017 ООО "Нойкем"