Россия

lab@ noykem.ru

Москва: (499) 346-39-14,  (495) 77-46-319   Новосибирск: (383) 363-85-90 (многоканальный)

Наша задача - обеспечивать Ваши лаборатории качественной продукцией

 

Автор: 
Хрунык Юлия Ярославовна (старший научный сотрудник), соавторы: Порываева А.П., Бахарев А.А., Вялых И.В., Петропавловский М.В., Шкуратова И.А.
Организация: 
ГНУ Уральский научно-исследовательский ветеринарный институт РАСХН, г. Екатеринбург
 
Конкурсная работа: 
 

   Многие клетки млекопитающих, прежде чем приступить к пролиферации и образовать клеточный монослой, должны прикрепиться к субстрату и «распластаться» на нем. В качестве субстрата в настоящее время используют несколько материалов, самыми распространенными из которых являются стекло и пластик. Рост клеток в клеточной культуре связан с образованием множества адгезионных контактов между клетками и материалом посуды. Такие контакты осуществляются с помощью адгезионных белков – фибронектина, витронектина и др. Кроме того, адгезия клеток осуществляется за счет электростатических взаимодействий, поэтому поверхность культуральных сосудов должна быть смачиваемой и отрицательно заряженной.

 

   Целью данного исследования было сравнение адгезии и пролиферативной активности двух клеточных культур (диплоидной линии клеток легкого эмбриона человека ЛЭЧ-4/81 и перевиваемой клеточной линии почки теленка MDBK) в зависимости от инкубирования в разных культуральных флаконах: стеклянных и пластиковых (швейцарской компании TPP и другого производителя).

 

Материалы и методы исследования

   В работе использовали диплоидную линию клеток легкого эмбриона человека (ЛЭЧ-4/81) и перевиваемую клеточную линию почки теленка MDBK, любезно предоставленные лабораторией клеточных культур Екатеринбургского научно-исследовательского института вирусных инфекций. В качестве питательной среды использовали смесь сред Игла-DMEM и Игла 199 в соотношении 1:1 (производство ФГУ НИИ полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М.П. Чумакова, Москва) с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки ЭТС (НПО «ПанЭко», Москва). При пересеве культуры клеток питательную среду из флаконов сливали, монослой клеток заливали теплым раствором Версена-Трипсина (1:1) температурой 20-37°С в объеме 10-15 мл на 6-10 минут. Затем раствор Версена-Трипсина сливали и вносили питательную среду в объеме 5 мл и взбалтывали. 1 мл клеточной культуры отбирали для подсчета клеток в камере Горяева. Исходя из полученных при подсчете данных делали разведение с целью получения 80-100 тыс. клеток/мл в посадочной клеточной культуре. Клеточные культуры инкубировали в пластиковых флаконах двух видов: TPP (Швейцария) и другого производителя, площадью по 25 см2 (рис. 1). В качестве контроля использовали стеклянные флаконы.

Рис. 1. В каждый флакон вносили по 10 мл клеточной культуры MDBK с посадочной концентрацией 88 тыс. клеток/мл. Для исследования использовали 3 вида разных флаконов: 1,2 – стеклянные флаконы; 3,4,5,6 – пластиковые флаконы.

   Флаконы с культурой клеток расчерчивали по диагонали для определения полей подсчета. Индекс адгезии (прилипания) клеток (ИАК) определяли через 24 часа инкубирования по формуле   , где А – посадочная концентрация клеток в 1 мл; В – концентрация клеток в 1 мл ростовой среды через 24 часа инкубирования. Индекс пролиферации определяли как отношение количества клеток через 48 часов (К2) к количеству клеток через 24 часа (К1) по формуле К2:К1.

 

Результаты исследования и обсуждение

   Посадочные концентрации клеточных культур составляли 88 тыс. клеток/мл и 180 тыс. клеток/мл для MDBK и ЛЭЧ-4/81, соответственно. При микроскопии флаконов с культурой клеток ЛЭЧ-4/81 после 24 часов инкубирования выявлено образование однородной популяции веретенообразных клеток с некоторым количеством не прикрепившихся к субстрату округлых клеток (рис.2).

Рис. 2. Микроскопия ЛЭЧ-4/81 после 24 часов инкубирования в флаконах TPP (а), флаконах другого производителя (б) из пластика и стеклянных флаконах (в). После того, как клетки ЛЭЧ «распластались» по субстрату, они принимают веретенообразную нативную форму. Желтые стрелочки указывают на округлые неприкрепившиеся клетки.

 

   Индекс адгезии клеток ЛЭЧ-4/81 культивируемых в пластиковых флаконах был почти одинаковым и составлял 73,3% и 73,5% для TPP и аналогичной посуды другого производителя, соответственно (таблица 1). Этот показатель несколько превышал значение индекса адгезии ЛЭЧ-4/81 инкубируемых на стеклянном субстрате, который составлял 66,7%.

Таблица 1. Индекс адгезии ЛЭЧ-4/81 в трех параллелях.

№ пробы Стеклянный флакон Пластиковый флакон другого производителя Пластиковый флакон ТРР
В
103кл/мл
ИАК
%
В
103кл/мл
ИАК
%
В
103кл/мл
ИАК
%
1 58,9 67,3 47,7 73,5 48,8 72,9
2 61,7 65,7 47,3 73,7 47,9 73,4
3 59,2 67,1 48,3 73,2 47,5 73,6
59,9 66,7 47,8 73,5 48,1 73,3

   При микроскопии флаконов с культурой клеток MDBK после 24 часов инкубирования выявлено наличие клеток полигональной формы, прикрепившихся к субстрату (рис. 3). Адгезия клеток MDBK, как и в случае с ЛЭЧ, была схожей для культур, инкубируемых в пластиковых флаконах и превышала значение индекса адгезии в культуре, инкубируемой в стеклянном флаконе (таблица 2). Отсюда можно сделать вывод, что клетки в обеих культурах прикреплялись к пластиковым флаконам лучше, чем к стеклянным. Возможно, это связано с более ровной поверхностью пластика. Однако, существенной разницы между индексами адгезии в пластиковых флаконах двух разных производителей не наблюдали.

 

Таблица 2. Индекс адгезии MDBK в трех параллелях.

№ пробы Стеклянный флакон Пластиковый флакон другого производителя Пластиковый флакон ТРР
В
103кл/мл
ИАК
%
В
103кл/мл
ИАК
%
В
103кл/мл
ИАК
%
1 56,9 35,3 48,2 45,2 47,4 46,1
2 54,5 37,9 49,3 43,9 47,8 45,7
3 56,7 35,6 49,6 43,7 47,3 46,7
56,0 36,3 49,0 44,3 47,5 46,2

 

Рис. 3. Микроскопия MDBK после 24 часов инкубирования в флаконах TPP (а), и другого производителя (б) из пластика и стеклянных флаконах (в). После того, как клетки MDBK распластились по субстрату, они принимают полигональную нативную форму. Черные стрелочки указывают на округлые неприкрепившиеся клетки. Неприкрепившиеся клетки в стеклянном флаконе видно очень плохо из-за оптических свойств стекла.

 

   Значение индекса пролиферации клеток ЛЭЧ-4/81 и MDBK, культивируемых в разных флаконах, было схожим для всех трех типов флаконов (таблица 2). Из этого следует, что пролиферативная активность клеток не изменилась в зависимости от культивирования на исследуемых видах субстрата.

 

Таблица 3. Индекс пролиферации клеток ЛЭЧ-4/81 и MDBK через 48 часов инкубирования.

№ пробы Стеклянный флакон Пластиковый флакон другого производителя Пластиковый флакон ТРР
К1 К2 ИП К1 К2 ИП К1 К2 ИП
ЛЭЧ-4/81 120,1 231,8 1,8 132,2 246,1 1,9 132,0 247,2 1,9
MDBK 32,0 49,7 1,6 39,0 61,7 1,6 40,5 64,8 1,6

При микроскопии клеток через 94 часа выявлено наличие монослоя MDBK и ЛЭЧ-4/81 во всех исследуемых флаконах (рис. 4).

 

Рис. 4. Микроскопия сформировавшегося монослоя ЛЭЧ-4/81 (а, б) и MDBK (в, г) после 96 часов инкубирования в флаконах TPP (а, в), и другого производителя (б, г).

 

Выводы

   Таким образом, оба вида пластиковых флаконов являются пригодными для культивирования клеточных культур, используемых в ветеринарной вирусологии. Однако следует отметить следующие положительные особенности пластика компании TPP: удобство маркировки, высокую прозрачность, удобную и четкую градуировку объема клеточных культур, а также то, что крышки флаконов удобно и плотно открываются и закрываются.

 

Это интересно!

Самка таракана способна за год отложить более двух миллионов яиц. Кроме того, таракан может девять дней жить без головы.

НАШИ ПРОЕКТЫ

 

КУЛЬТУРАЛЬНАЯ ПОСУДА

ВИДЕО     ОБЗОР ТОВАРОВ     КАТАЛОГ

 


 

КРИОГЕННОЕ ОБОРУДОВАНИЕ

ВИДЕО     ОБЗОР ТОВАРОВ     КАТАЛОГ

ЗАПОЛНИТЬ КРИО АНКЕТУ

 


 

КОМПЛЕКСНЫЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

 

 

для центров ЭКО:   сайт   прайс

           для ЦГиЭ:   сайт   прайс

 


 

ОПТОВЫЕ ПОСТАВКИ РЕАКТИВОВ

Касторовое масло LUVOTIX R

1,4-Нафтохинон

Корзина

Итоговая сумма:   0.00 Руб.
В корзину
www.noykem.ru
lab@ noykem.ru
(499) 346-39-14, (495) 77-46-319
(383) 363-85-90 (многоканальный)

 


Copyright (с) 2013 - 2018 ООО "Нойкем"